nCounter多组学分析技术介绍

nCounter荧光条码多重分析系统是一种革命性的基于荧光条码探针的高通量分析技术。该技术利用不同颜色顺序组合的荧光条码信号标记oligo探针,可同时检测来源于同一样本的DNA,RNA和蛋白质。nCounter技术运用独创的信号捕获方式,检测过程无需传统核酸定量的逆转录和PCR扩增,也不需表达谱芯片所需的标记和逆转录以及二代测序RNA-Seq定量中的繁琐建库过程,直接对样本中的待测靶标进行计数分析,可广泛应用于各类生物样本分析,包括石蜡切片(FFPE)、组织提取物、细胞裂解物、血浆和其它生物流体样本等。其中,该技术在石蜡样本的转录组分析中有着无可比拟的优势,其对RNA降解的耐受性十分强大,定量的准确性远超传统荧光定量PCR和RNA-Seq,是临床组织样本表达谱分析的最佳解决方案。

为了使各位专家学者更好地了解nCounter技术,并将其优势结合到自己的科研项目中,我们对该技术做一下概括性介绍。

基本原理

nCounter分析技术是NanoString公司开发的具有独创技术原理的多组学表达谱分析技术。该技术由一系列探针组(CodeSet)组成,针对每个靶基因有一对特殊设计的探针,其中捕获探针是由一段生物素偶连的50个碱基组成(50-mer)的复合物,报告探针则是由一段荧光条码偶连的50个碱基(50-mer)的复合物。该配对探针与靶基因进行特异性杂交,杂交产物通过生物素固定在特殊的固相基质上,在电场的作用下按一致方向顺序排列,最后通过高分辨扫描技术对报告探针进行计数,计数统计结果直接反映各个靶分子丰度。荧光探针由四色荧光基团按不同顺序排列组合而成,可形成多至800种可分辨组合。

该技术唯一的化学反应步骤为核酸杂交形成复合物,无需反转录和传统酶促PCR扩增,也不需要基因芯片分析中的样本化学标记或NGS中的建库过程,整个过程更为简单且快速稳定,可将实验中的内源性和外源性误差最小化,尤其适合不稳定性高的样本分析,如易降解的RNA样本,是石蜡样本基因表达谱分析的理想解决方案。nCounter技术不仅适用于高通量表达谱分析,也适用于SNP,CNV,microRNA和蛋白表达谱分析。其中和MD安德森Mills教授团队共同开发的基于nCounter的3D Biology多组学分析技术是一项革命性的技术,可在同一样本中实现DNA,RNA和蛋白的共分析。

  • nCounter技术基本原理
  • 相关常用基因表达谱分析技术比对

技术流程

1.杂交:荧光条码探针直接与液相中的目标分子杂交。其中报告探针携带信号,捕获探针用来固定复合物以进行数据采集。
2. 纯化固定:转移样品至nCounter Prep Station,多余探针被洗脱,探针/目标分子的复合物结合、固定并排列在样品板上。
3. 数字数据采集:样品板放在计数器数字分析仪中进行数据采集。对每个目标分子的荧光条码进行计数并以表格形式呈现。
4. 通过nSolver软件进行分析,包括质控、数据处理和表达谱定量。

nCounter技术基本流程及特点

技术应用场景和优势------临床石蜡样本的最佳解决方案

新一代FFPE石蜡样本分析金标准技术

石蜡样本的RNA表达谱分析一直是困扰科学家的一个广泛性问题。nCounter技术的强大优势主要体现在对临床石蜡样本的RNA表达谱分析中。运用鲜冻样本和配对石蜡样本进行转录组数据比对,和临床广泛应用的Q-PCR技术相比,nCounter在分析中有着十分明显的优势,与配对鲜冻样本结果一致性更高,结果更加稳定(1)。nCounter技术在中通量珍贵样本表达谱分析中也体现出了其它技术所不具备的优势,得益于其特有的杂交技术无需反转录和扩增等步骤,因此对RNA质量的容忍度极高,RIN值的可接受范围在3-10之间,可作为临床回溯性分析的完美解决方案。该技术既可以作为对高通量基因芯片和RNA-seq的结果进行大样本验证的策略,也可以独立开展对石蜡大样本的系统性分析,更好地与其它组学数据和临床数据相结合,实现临床多组学共分析的目的。

nCounter与Q-PCR技术在石蜡样本和配对鲜冻样本中的相关性比对

MD安德森癌症中心Mills教授早在2012年就运用nCounter对乳腺癌FFPE样本进行分析,通过对49例样本进行355个基因的分析,Mills博士团队及合作团队验证了nCounter技术强大的样本耐受度。在仅有25ng总RNA的样本量前提下,实验间重复的相关性达到了0.9985以上,也验证了该技术无需技术重复的样本优势,因此更加适合于珍贵临床样本的研究(2)。

示例FFPE样本RNA质控数据(Agilent 2100 Bioanalyzer)和nCounter技术样本重复相关性示例图

样本前处理便捷性

RNA提取作为基因表达谱分析的前处理步骤是任何相关技术应用的前提,然而不同的提取法和前处理过程均会对样本产生影响,从而影响RNA的提取量和稳定性,引入难以避免的实验误差。nCounter分析可大大简化该流程,直接分析细胞裂解液(如体外培养细胞和血球细胞裂解液),无需进行RNA抽提,节省了大量时间和成本,同时可以实现对靶基因的精确定量。

斯坦福大学Garrison Fathman教授在一型糖尿病外周血基因表达谱分析的研究中,通过nCounter技术直接裂解全血,进行基因表达谱分析,并比对两种RNA提取法介导的表达谱分析(PAXgene系统和Tempus系统),证实了nCounter能够更加准确反映临床样本中的基因表达状态,而PAXgene系统和Tempus系统则存在一定程度的RNA降解,影响数据质量(3)。

PAXgene,Tempus与全血表达谱分析对比(COX7B,LSM3与KIF20B基因)

nCounter表达谱分析技术在肿瘤学、免疫学、自免疫疾病、神经生物学、心血管疾病、糖尿病、传染性疾病、干细胞研究、单细胞分析等各个领域都有着不同程度的应用,技术普及程度和应用发展趋势也是逐年上升,截止2019年,相关累计论文发表超过3000篇。作为新一代的基因分析技术,nCounter分析技术已经为我国的科研领域提供了全套新的解决方案,并以科研为本,朝转化医学和临床应用方向不断发展。

  • nCounter技术相关发表领域汇总(截止2019年8月)
  • nCounter技术发文数量和趋势统计(截止2019年8月)

主要应用方向

  • 肿瘤学
  • ------肿瘤免疫学
    ------CAR-T表达谱分析
    ------肿瘤生物学通路
  • 免疫学
  • ------自免疫疾病及相关研究
    ------炎症相关
    ------天然免疫
    ------灵长类生物免疫学
  • 神经生物学
  • ------神经病理学
    ------神经炎症研究
    ------阿兹海默症
  • 其它
  • ------代谢通路研究
    ------人类器官移植
    ------组织纤维化研究

其它还包括一些列基因融合,拷贝数变异CNV以及3D Biology多组学共分析Panel。nCounter技术支持用户定制靶点,可根据不同项目需求开发针对性的基因和基因Panel,使得应用场景更加灵活。

部分服务项目内容(肿瘤学相关)

其它表达谱分析Panel,SNP,CNV和3D Biology相关Panel请咨询售前技术支持。

我们的服务优势

Mills博士作为nCounter 3D Biology技术的共同发明人以及nanoString技术的长期合作伙伴,是该技术领域公认的国际先驱。在Mills癌症个体化诊疗研究中心,我们组建了以nCounter技术为核心的基因蛋白组学实验室,并与DSP数字空间分析系统共同组成了集转录组、蛋白组和空间组为一体的多组学分析中心。同时结合RPPA反相蛋白微阵列技术,在肿瘤系统生物学领域和临床组织样本多组学分析中着独一无二的强大技术优势。

服务流程

如需了解更多nCounter相关信息或定制感兴趣的基因,请登录非因生物网站或与我们的售前技术支持取得联系。

参考文献

1.Patricia R, Levi W, et al. mRNA transcript quantification in archival samples using multiplexed, color coded probes. BMC Biotechnology 2011; 11:46
2.Balko J, Cook R, et al. Profiling of residual breast cancers after neoadjuvant chemotherapy identifies DUSP4 deficiency as a mechanism of drug resistance. Nature Medicine 2012; 18:7
3.Yip L, Fuhlbrigge R et al. Impact of blood collection and processing on peripheral blood gene expression profiling in type 1 diabetes. 2017; 18:636