RPPA在淋巴瘤研究中的应用

杂志名称: Blood:10.1182/blood-2018-03-838524 IF 15.132
文献题目: 分子图谱揭示DUSP22重排在间变性大细胞淋巴瘤中的免疫原信号
试验样品:新鲜冰冻组织

研究背景
间变性大细胞淋巴瘤(ALCLs)是CD30阳性T细胞非霍奇金淋巴瘤的一种独立亚型,大多分为ALK+和ALK-两种类型。ALK+的ALLs总是在ALK酪氨酸激酶基因重排,但是ALK-的ALLs在临床和遗传上有多相性。大约30 %的ALK - ALCLs有DUSP22的重排,并且在治疗中有很好的长期疗效。为了更好地理解这组肿瘤,我们基于基因表达谱评估它们的分子特征。DUSP22重排的ALCL属于ALCL的一个独特亚型,它缺乏与JAK - STAT3信号相关的表达基因,而JAK - STAT3信号是促进大多数ALCl生长的途径。RPPA和免疫组织化学研究证实了DUSP22重排ALCLs中缺乏活化的STAT3。重排DUSP22 ALCLs过度表达免疫原性睾丸癌症抗原( CTA )基因。并通过硫酸氢盐测序和DNA甲基化阵列显示出明显的DNA低甲基化。ALCL细胞中的药物DNA去甲基化导致了CTAs和其他DUSP22特征基因的过度表达。此外,与其他ALCLs相比,DUSP22重排的ALCLs中PD - L1低表达,但共刺激基因CD58和HLA II类具有高表达。
这些发现表明DUSP22重排定义了一个不同的ALCLs亚组,与抗原性、共刺激分子表达和PD - 1 / PD - L1免疫不活动相关的免疫原信号可能有助于他们的良好预后。

  • 研究方法
    RPPA
    从新鲜冰冻组织样品中提取蛋白质,并在MD安德森癌症中心RPPA平台上使用STAT3和pSTAT3Y705抗体进行蛋白及翻译后修饰表达分析。

    病人和样本
    RPPA
    来自31个ALCLs ( 8个ALK阳性,16个ALK阴性,7个原发性皮肤癌)的冷冻肿瘤组织标本构成了一个组( 女性:男性,20 : 11;平均年龄,51岁)。在研究中也分析了一组独立ALCLs的福尔马林固定石蜡包埋( FFPE )组织。基于组织切片、DNA和RNA的可用性,该组的子集被用于验证试验。

    通过反相蛋白微阵列(19例可用样本),具有低STAT3基因表达的簇1中的ALCLs也显示出低表达的总STAT3蛋白和低表达的pSTAT3Y705。

    通过验证集334例FFPE样本,我们证实了pSTAT3Y705在DUSP22重排病例中表达量显著降低。

    DUSP22重排病人的总生存率显著高于未重排的病人。也揭示了JAK - STAT3下调意味着病人将会有更为良好的临床表现。

RPPA在黑素瘤研究中的应用

杂志名称: Nature 2017 10.1038/nature24040 IF: 41.577
文献题目: PAK信号驱动BRAF突变型黑素瘤获得对MAPK抑制剂的耐药性
试验样品: 体外培养细胞,PDX细胞系

研究背景与目的
靶向BRAF抑制( BRAFi )和BRAF与MEK联合抑制( BRAFi和MEKi )疗法显著改善了转移性黑色素瘤患者的临床疗效。但这些治疗的功效常常会受到耐药性的影响。在这里,我们研究了在BRAFi和联合治疗获得抗性的分子机制。与以前的研究一致,对BRAFi的抗性是通过ERK途径激活介导的。然而,在许多耐药细胞系和临床样本中,对联合用药治疗的耐药性是由与ERK激活无关的机制介导的。我们对此耐药性做了更加深入的研究。

研究方法
反相蛋白阵列( RPPA )检测用安德森癌症中心RPPA平台完成,BR细胞(BRAF抑制剂耐受型细胞),BR-PDX细胞,CR细胞(BRAF和MEK抑制剂同双耐受性细胞)样本均使用50μg总蛋白进行。抗体通过WB得到验证。

结果
通过WB检测,PAKs能够通过在S338位点直接磷酸化CRAF和在S298位点磷酸化MEK来激活ERK 。我们发现BR细胞中p - CRAF ( S338 )和p - MEK ( S298 )都显著增加,BR细胞系中PF - 3758309下调MAPK信号。

  • 为了全面了解抑制PAK后BR细胞系中改变的信号通路,我们用PAK拮抗剂PF - 3758309处理BR细胞系,也包括由BR患者来源的异种移植物( BR-PDX )建立的细胞系,并使用RPPA对它们进行分析。我们发现PF - 3758309治疗检测到几个主要变化: ( 1 ) 抑制MAPK路径,如p - ERK ( T202 / Y204 )及其下游目标p - c - JUN ( S73 ) (也称为p - JUN ( S73 ) )的减少;( 2 ) 抑制细胞周期进程,如FOXM1、细胞周期蛋白B1和CDK1减少,同时p - Rb减少( S807 / S811 );( 3 )抑制mTOR信号,如p - S6 ( S235 / S236 )、p - S6 ( S240 / S244 )、p - 4E - BP1 ( S65 )和p - 4E - BP1 ( T37 / T46 )的减少

同样通过RPPA,在CR细胞中,我们发现PF – 3758309对p – ERK的影响并不大,但是却会抑制ERK下游通路蛋白p-ELK1(S383)以及p-RSK(T359/S363)的磷酸化水平。同时m-TOR通路上的p-4E-BP1以及p-S6的磷酸化水平有显著降低。在PAK1的持续活化1205LuCR细胞中,没有导致由PLX4720(RAF抑制剂)和PD032901(MEK抑制剂)作用而产生的ERK1活化,却导致了细胞周期活化(上调p-Rb和p-cyclin B1)。
通过WB,我们也验证了RPPA实验的结果。

我们用DMSO或PF - 3758309处理不同BR细胞系和BR-PDX细胞系48小时。然后用RPPA分析细胞裂解物,并使用R中的LIMMA包分析数据。热图中显示了鉴定的蛋白质水平( PF - 3758309处理后至少四个BR细胞系与DMSO相比有显著变化,P<0.01 )。每种色标为所有样品均值标准化后log2转换。
结果显示:1.MARK信号通路下调,2.细胞周期抑制,3.mTOR信号通路抑制

对于CR细胞,PF-3758309并不像BR细胞中观察到的那样显著影响ERK的磷酸化,而是抑制ERK、p-ELK1 ( S383 )和p-RSK ( T359 / S363 )的下游靶点。此外,mTOR途径活性大部分被抑制,如p-4E-BP1和p-S6的降低。

  • 我们还使用RPPA和免疫印迹检测了在亲本细胞系1205Lu中表达组成型活性PAK1的效果。在没有PLX4720的情况下,PAK1107F/423E(持续活化型)对细胞的作用有限,但减弱了PLX4720对p - MEK1 ( S217 / S221 )、p - ERK ( T202 / Y204 )、p - S6 ( S235 / S236和p - S6 ( S240 / S244 )的抑制作用。

结论
p21激酶( PAKs )作为一种关键性介导蛋白,在获得性耐药性的细胞中被激活,并在促进耐药性中起着关键作用。我们使用RPPA进行筛选,揭示了PAKs介导对BRAFi和联合治疗的耐药性的不同机制。在抗BRAFi细胞中,PAKs磷酸化CRAF和MEK以重新激活ERK。在对联合治疗有抗性的细胞中,PAKs调节JNK和β-连环蛋白磷酸化和mTOR途径激活,抑制细胞凋亡,从而绕过ERK。总之,我们的结果提供了对当前靶向治疗获得性耐药性的分子机制的深入了解,并可能有助于指导新的药物开发和联合用药方法来克服获得性耐药性。

RPPA在卵巢癌和子宫癌中的应用

杂志名称: Journal of National Cancer Institute 2017 10.1093/jnci/djw296 IF: 11.238
文献题目:YAP1作为AKT和P70S6K在卵巢和子宫恶性肿瘤中的抑制作用敏感性的标记物
试验样品:体外培养细胞样本

研究背景
•PI3K/AKT/mTOR通路在涉及肿瘤发病机制中起关键作用。PIK3CA 基因是一种常见的突变致癌基因,影响超过 30%的实体瘤;PTEN,编码磷酸酶和张力蛋白同系物,经常被突变或抑制,导致 PI3K/AKT信号通路的激活。卵巢癌和子宫癌的分子改变的高频率代表 一个重要的治疗机会。
•AKT/P70S6K双重抑制通过加强对PI3K/AKT通路的抑制提供了一种新的治疗方法, 同时避免了AKT活化的负面影响。此外,在实体恶性肿瘤中,抑制过度激活的通路下游的两个靶点可以避免与之相关的副作用 。
•MSC2363318A是一种高度选择性激酶,是AKT1, AKT3和P70S6K的ATP竞争性抑制剂。本文研究了MSC2363318A在小鼠卵巢和子宫原位模型中的应用的生物效应 , 并确定YAP1是一个潜在的反应预测标志物。

研究方法
将bevacizumab敏感性细胞Igrov1, Ovcar5, Hec1b, Ishikawa, RL95-2 KLE, RF-24和对bevacizumab耐药的RF-24细胞分别用1 mM MSC2363318A处理18小时。收集细胞,通过MD安德森RPPA平台进行分析。

为了发现对MSC2363318A的潜在反应标记物,在MSC2363318A (1μM) 治疗卵巢( Igrov1和Ovcar5 )和子宫( Hec1b、Ishikawa、KLE和RL95 - 2 )癌细胞系后18小时使用RPPA对处理前后蛋白表达差异进行分析(图A )。

鉴于体内外对血管生成的强大影响,我们研究了上调蛋白与血管生成信号通路相关蛋白,将IPA网络分析与耐受性和敏感性总蛋白变化的比例进行覆盖(图 B)。发现了YAP1在耐受细胞系显著升高,我们将RPPA数据提取出来,发现YAP1和pYAP1的RPPA数据的对数比值(图C),在耐药细胞系中YAP1的表达更高。

我们通过免疫印迹分析平均YAP1蛋白表达 (图4D)在一组子宫癌和卵巢癌细胞系中进行评估和定量 Spearman’s 相关性(R=0.54 P=0.02),表明耐药细胞株YAP1有更高的表达,反之亦然(图E)。也证实了RPPA的分析结果。
后续细胞转染结果进一步表明, MSC2363318A耐药与YAP1蛋白的高表达相关,但并不依赖于 YAP1蛋白的高表达。

结论
本研究发现了AKT和P70S6K的双重抑制在多种临床前模型中通过增强细胞凋亡、抑制增殖和减少血管生成具有治疗效果。用MSC2363318A和紫杉醇的组合,在卵巢和子宫癌细胞中观察到协同作用。抗血管生成治疗中加入MSC2363318A增强了贝伐单抗的作用,并恢复了耐药组的敏感性。最后,将YAP1鉴定为MSC2363318A的敏感性相关标记物。
MSC2363318A在晚期恶性肿瘤患者中的一期临床试验最近已经开始。理论上,YAP1高表达、PI3K/AKT活化增加的卵巢和子宫内膜肿瘤患者可以从MSC2363318A治疗中获益最大。
综上所述,基于MSC2363318A的治疗可能对卵巢癌和子宫癌患者有治疗上的益处, YAP1是对此类治疗的敏感性的一个潜在的预测生物标志物。

RPPA在三阴性乳腺癌TNBC临床试验中的应用

杂志名称:Annals of Oncology 2014, 10.1093/annonc/mdu124 IF: 13.926
paclitaxel联合FEC标准新辅助化疗与paclitaxel联合everolimus联合FEC治疗三受体阴性乳腺癌的开放性随机临床研究(Clinical Trial number:NCT00499603)

研究背景
三阴性乳腺癌(TNBC)缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2的表达,占乳腺癌的12-17%。新辅助化疗(NCT)后的病理完全反应(pCR)是TNBC存活的早期疗效指标,30-40%病人收益,而剩余病人则存在复发风险。PI3K/AKT/mTOR通路是肿瘤中最常见的生长因子酪氨酸激酶受体的下游通路。它在细胞生长、蛋白质翻译、自噬、代谢和生存中起关键作用,在TNBC中也存在高表达。抑制此通路在体外细胞学实验中证明Rapamycin可以增强紫杉醇对PI3K/PTEN/AKT畸变细胞系的细胞毒性,提示联合治疗可能对这些肿瘤有效。口服mTOR抑制剂everolimus能在体外和体内协同增强紫杉醇诱导的乳腺癌细胞毒性,并且具有直接抗增殖活性。该研究基于临床试验,分析了mTOR抑制剂与标准新辅助化疗连用后mTOR信号通路的分子机理。

  • 研究方法:
    总共50例,随机分成T-FEC(27)和TR-FEC组(23)
    样本获取时间(细针穿刺法)
    1. 治疗前;
    2. 药物介入48小时后;
    3. 12周;
    4. 术中

结果
起始的时候,蛋白表达水平没有差异,更进一步验证了样本挑选的随机性;48h时,蛋白质的变大出现了显著变化。在T-FEC组中,有70种蛋白质有显著变化,包括PI3K AKT mTOR-通路成分(pS6-S240 244、pS6-S235 236、pAkt0S473和4EBP1)。比较T-FEC和TR-FEC组发现核糖体S6蛋白的磷酸化差异显著;在T-FEC组,pS6-S240 244和pS6-S235 236增加,而在TR-FEC组则恰恰相反;

结论
本研究旨在探讨在标准NCT中加入mTOR抑制剂后TNBC患者PI3K AKT mTOR途径的早期分子变化;研究发现对照组TR-FECS6磷酸化降低、pAKT升高,与mTOR抑制作用一致;PI3K信号转导活性在NCT后残余疾病患者中存在,并与不良预后相关;也进一步证实了PI3K通路活化导致了预后不良。mTOR抑制剂Everolimus与紫杉醇联合使用具有良好的耐受性。在TR-FEC组中,Everolimus下调mTOR信号,但48小时候下调的mTOR与12周响应率RR无显著相关性。