RPPA与正相微阵列(抗体芯片)的比对

正相微阵列(Forward Phase Protein Arrays FPPA) 主要以抗体微阵列为主,也称之为抗体芯片。它是将多种抗体(识别不同抗原)包被在固相载体上,然后加入待测样本,再利用识别同一抗原不同表位的抗体对进行免疫反应,最终通过各类信号放大的方法进行数据读取。正相芯片由于操作简便,仅需相应的信号读取设备就可以在实验室开展相关筛选靶点分析研究,是传统意义上的蛋白微阵列技术,在科研领域有着较为广泛的应用。抗体微阵列同时存在一些弊端,从技术角度主要有以下几个方面:1.因靶点通量较高,大多数情况下需对样本进行标记,通常为生物素标记或荧光标记,这类化学修饰(通常为共价偶联)会对样本本身产生影响,如样本标记效率不同会对实验结果产生一定影响,造成假阳假阴产生。2.一般集成型高通量筛选芯片检测非变性蛋白,抗体识别过程中存在抗原决定簇未暴露的情况,会对蛋白定量产生影响,造成一定误差。3.由于此类蛋白微阵列为一个样本在一个单元内进行免疫反应,存在实验间误差,内参样本并不支持样本间及实验间对照,在大量样本的比对中不占优势,不太适合大样本平行分析。4.抗体微阵列在分析组织来源样本时有技术瓶颈,存在不可避免的背景噪音干扰信号,因此不太实用于组织样本分析。目前正相微阵列主要面向科研级产品应用。如Ray Biotech的各类抗体芯片产品,Full Moon BioSystems各类芯片以及Clontech的Ab Microarray 380等。

相较与正相抗体微阵列技术,反相蛋白微阵列(Reverse Phase Protein Arrays RPPA)的应用场景和所解释的科学问题则是一个不同层级上的。从技术角度讲,RPPA每个微阵列仅需一个抗体进行反应,并且在一同反应单元内对成百上千例样本进行仅进行同时分析,消除了实验间误差,且RPPA免疫反应在蛋白全变性的条件下进行,排除了FPPA在非变性条件下潜在的蛋白高级结构变化,使定量更为精准。除了常规的阴性阳性内参以外,RPPA微阵列内设置了各种不同对照,用来进行芯片内部区域校正和进行实验间比对,大大增强了数据的可用性。RPPA技术仅须几十微克总蛋白即可完成300-500个靶点的分析,尤其是在实体组织样本的分析中有着无可比拟的优势,采用抗原在下的方式(Antigen-down)解决了抗体芯片的瓶颈,无背景干扰,特别有利于组织蛋白表达谱分析。

RPPA:与其它主流芯片技术的区别

RPPA与质谱蛋白组技术的比对

从技术原理来讲,RPPA技术区别于质谱技术,属于基于免疫反应的蛋白组学技术手段。作为De-novo检测方法,质谱有着别的蛋白组学无可比拟的优势,尤其是在蛋白新标靶研究和生物标志物探索中,有着免疫学技术所不具备的优势。而从定量能力上来说,RPPA技术所拥有的定量能力则是质谱蛋白组定量所不可比拟的,荧光差异宁家电泳分析DIGE (Differential in-gel Electrophoresis)技术基本已经逐渐被高速发展的高精度质谱仪所取代,但纵使目前质谱技术不断发展,从方法学角度来说,目前除了主流i-TRAQ,TMT,SILAC,SRM以及Label-free技术以及SWATH(DIA)等高精度质谱分析方法外,无其它具有突破性的定量检测手段在质谱领域得到开发。质谱定量的决定性因素很多,在样本层面包括样本处理,消化,标记和液相色谱以及仪器分析等,每一步反应都对最终定量产生无法避免的干扰。在分析层面,信号压缩(Signal Compression)也是标记定量的一个无法避免的劣势,而通过Spectrum-counting得到的定量效果受到更多因素的干扰,远不如免疫组定量来的直接可靠

质谱蛋白组学分析需要进行数据库比对来确定蛋白ID及相关修饰,通过序列比对来进行蛋白鉴定的优势在于结果准确,同时高丰度蛋白会对低丰度蛋白鉴定产生干扰,同时存在对低丰度蛋白以及蛋白翻译后修饰蛋白的解析错误,是低丰度蛋白检测和定量的技术的瓶颈,而低丰度蛋白往往是研究者更为关注的蛋白,比如细胞信号蛋白以及相关修饰蛋白,而RPPA技术刚好弥补了质谱在这些方面的不足,并可同时实现这类蛋白的系统性,功能性研究。液质串联质谱技术对样本进行分析采用连续进样法,实验间会存在一定误差,稳定性与重复性较免疫法来说不占优势。RPPA技术则具有很强的耐受度,且在样本相对定量中有着极大优势,尤其是在珍贵临床组织样本分析比对中有着质谱不可比拟的优势。在药物研发领域,RPPA也完全超越质谱蛋白组技术,是系统性药理学分析强有力的支持手段。全美最大的泛癌分析项目TCGA就是以临床样本作为切入点进行多组学共分析,采用的蛋白组学技术即为RPPA,并建立了癌症临床蛋白组学数据库,RPPA很好低发挥了在临床大样本分析中的优势,虽然后续质谱技术也得到了一定应用(CPTAC),但数据完整性和系统性尚未达到RPPA蛋白组分析的广度与深度。总的来说,RPPA更加侧重于靶向蛋白组以及系统生物学和功能蛋白组学研究,尤其是在系统药理学研究和临床样本分析上,有着其它高通量蛋白组技术无可比拟的优势。

抗体芯片,质谱蛋白组,反相蛋白微阵列技术优劣势比对

如何选择正确有效的蛋白检测技术来提高科学研究效率