RPPA技术历史背景简介

RPPA反相蛋白微阵列技术在2001年由Liotta和Petricoin博士共同发明,并通过分析前列腺组织,发现了促生长机制信号通路中Akt磷酸化水平升高以及ERK磷酸化水平的降低,同时伴随这细胞凋亡途径的抑制作用,这些分子现象随着癌症发生发展而逐渐上升。这项研究奠定了RPPA技术运用的基础。随着微阵列硬件技术的进步,RPPA的应用也在逐步拓广,并在全球各地实验室得到应用和发展,其中包括美国,德国,英国,法国,瑞士和日本等。在2006年之后RPPA技术得到了更为广泛的应用,在基础医学研究,转化医学,临床前研究,临床研究中,RPPA技术都得到了不同程度的应用。

RPPA发展历史

RPPA全球版图

RPPA领域文献发表趋势(2006-2018)

MD安德森与业内总体平均影响因子趋势(2006-2018)

Mills癌症个体化诊疗中心核心平台

RPPA技术背景简介

  • 基本原理
    反相蛋白微阵列技术(Reverse Phase Protein Array) RPPA 是一种基于平面微阵列技术,以免疫反应为检测手段的高通量检测分析技术。可以看成是一种定量高通量ELISA/斑点印迹法。该技术区别于传统的抗体微阵列检测技术,采用抗原在下的方式(Antigen-down),将从各类细胞,组织及体液中提取的蛋白混合物完全变性,通过高精度微阵列打印技术固定在特殊处理的平面微阵列上,然后利用抗原抗体免疫反应进行温育,再利用标记二抗进行信号捕获及放大,最终实现靶蛋白定量与数据比对分析。

  • RPPA基本原理
  • 作为一种高通量的多重蛋白靶点分析技术,RPPA具有其它高通量蛋白组学所无可比拟的超高灵敏度,可在15毫克组织中(米粒大小)分析多达500种以上低丰度蛋白,包括大量细胞信号蛋白,免疫通路蛋白,修饰蛋白(磷酸化,乙酰基化,甲基化)等,也可根据需求,定制所需研究的靶点蛋白进行分析,包括直接和间接的上下游蛋白网络分析,是其它蛋白组学技术手段所不具备的。RPPA技术在定量能力,重复性,样本间比对以及大样本分析能力上完全超越了传统的抗体微阵列技术Antibody Array(Forward Phase Protein Array),可实现上千例样本的几百种靶点平行比对,为药理学研究,药物研发,用药组合研究与生物标志物探索与验证提供了完美的解决方案。

  • RPPA免疫反应示意图

RPPA作为与基因组技术,转录组技术互补的蛋白检测技术,在美国泛癌研究项目TCGA中发挥了重要的作用,完成10000多例样本的蛋白组学信息采集分析。RPPA从系统生物学及功能蛋白组学的角度对样本进行高内含分析(High-content profiling),以精准用药作为切入点,正逐步发展成为基础科研,药物开发强有力的工具,并逐步朝临床伴随诊断方向靠拢,作为临床多组学研究的一个分支技术发挥着越来越重要的作用。

TCGA使用RPPA作为蛋白组学数据采集方法的链接:
https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga/using-tcga/types

RPPA微阵列微阵列示意图(源自MD安德森平台)

技术核心优势
强大的样本耐受度------分析全变性蛋白,消除表位的结构空间影响,使定量更为可靠。
样本类型丰富性------可分析各种来源的样本,包括体外培养细胞,小鼠异种移植模型,PDX模型,人源原代培养细胞,类器官,3D培养组织,冰冻组织,穿刺样本,石蜡切片,外泌体等。
微量样本需求-----仅需15毫克起始样本量或40微克蛋白提取液即可完成几百种靶点分析,特别适用于少量实体瘤组织来源样本,尤其适合肺癌,肝癌,胰腺癌和神经胶母细胞瘤等临床样本难获取的癌种。
高通量高内涵分析------同时对上千例样本的几百种蛋白进行平行比对分析,对寻找和验证生物标志物有着无可比拟的优势。
同一样本多重组学分析------可实现同一临床组织样本的多重分析,将基因组,转录组和蛋白组的数据整合分析,尤其针对珍贵的临床样本,具有极高的保真度。
高重复性和重现性------利用大量的由细胞系构建的内参样本,实现微阵列内及微阵列间的重复性评估,并通过特定内参实现实验间数据比对,使得大样本分析成为可能。

  • RPPA免疫反应示意图
  • 基于SuperCurve拟合的表达校正定量以及微阵列样本残差分析(源自MD安德森平台)

相关微阵列蛋白组学分析技术区别与优势

RPPA综合优势

样本范围

体外培养细胞   临床鲜冻组织样本   石蜡包埋样本   穿刺样本   体液样本   血液样本   PDX模型样本及其它异种移植物动物模型   3D培养物   类器官   其他样本(可联系技术部门定制)

应用领域

  • 1. 高通量功能蛋白组及细胞信号通路系统生物学研究
    ---细胞蛋白水平调控及细胞信号转导研究
    ---基于肿瘤生物学的分子机理系统性研究
    ---靶向药物及药物组合系统性研究
    ---系统生物学建模研究
    ---生物标志物探索与验证
    ---临床样本多组学共分析


  • 3. 系统药理学研究
    ---体内外药物靶点on-target/off-target研究
    ---药物作用机理MOA研究
    ---代偿性抑制与激活机理探索及验证
    ---高通量药物组合优化及验证

  • 2. 临床样本队列功能蛋白组学研究
    ---临床实体瘤样本队列研究
    ---临床样本的肿瘤标志物及靶点探索与验证
    ---肿瘤标志物临床意义及蛋白分子分型研究
    ---组织病理学蛋白组分型研究
    ---基因蛋白组学为基础的分子病理研究


  • 4. 靶向药物开发
    ---先导化合物机理验证与优化筛选
    ---靶向药物标志物开发与验证
    ---临床前药物剂量选择研究
    ---临床(前)安全性评估(on-target/off-target)
    ---临床前药物组合方案研究与验证
    ---临床试验药效评估
    ---临床试验入组人群筛选

基本流程图